Nieuw algoritme vindt veel genbewerkingsenzymen in omgevings-DNA

CRISPR – geclusterde korte palindromische herhalingen met regelmatige tussenruimtes – is het antwoord van de microbiële wereld op adaptieve immuniteit. Bacteriën maken geen antilichamen aan als ze worden binnengevallen door ziekteverwekkers en blokkeren die antistoffen vervolgens als ze dezelfde ziekteverwekker opnieuw tegenkomen, zoals wij dat doen. In plaats daarvan integreren ze een deel van het DNA van de ziekteverwekker in hun genoom en koppelen dit aan een enzym dat ze kunnen gebruiken om de DNA-sequentie van de ziekteverwekker te herkennen en deze in stukken te knippen als de ziekteverwekker weer verschijnt.

Het enzym dat het knipwerk doet heet Cas, naar CRISPR. Hoewel het CRISPR-Cas-systeem zich heeft ontwikkeld als een bacterieel afweermechanisme, is het door onderzoekers benut en aangepast als een krachtig hulpmiddel voor genetische manipulatie in laboratoriumstudies. Het heeft ook zijn toepassingen in de landbouw bewezen en de eerste op CRISPR gebaseerde behandeling is in Groot-Brittannië goedgekeurd voor de behandeling van sikkelcelziekte en transfusie-afhankelijke bèta-thalassemie.

Nu hebben onderzoekers een nieuwe manier ontwikkeld om genomen te zoeken naar CRISPR-Cas-achtige systemen. Ze ontdekten dat we misschien veel extra hulpmiddelen hebben om mee te werken.

DNA-modificatie

Tot nu toe zijn er zes soorten CRISPR-Cas-systemen geïdentificeerd in verschillende microben. Hoewel ze in details verschillen, hebben ze allemaal dezelfde aantrekkingskracht: ze leveren eiwitten aan een specifieke sequentie van genetisch materiaal met een mate van specificiteit die tot nu toe technisch moeilijk, duur en tijdrovend was om te bereiken. Elke DNA-sequentie die van belang is in het systeem kan worden geprogrammeerd en gericht.

Inheemse systemen in microben brengen doorgaans een exonuclease – een enzym dat DNA splitst – in de sequentie, waardoor het genetische materiaal van ziekteverwekkers wordt versnipperd. Deze mogelijkheid kan worden gebruikt om elke gekozen DNA-sequentie te knippen voor genbewerking; Gecombineerd met enzymen en/of andere DNA-sequenties kan het worden gebruikt om extra korte sequenties in te voegen of te verwijderen, en om mutante genen te corrigeren. Sommige CRISPR-Cas-systemen knippen specifieke RNA-moleculen in plaats van DNA. Ze kunnen worden gebruikt om ziekteverwekkend RNA, zoals de genomen van sommige virussen, te elimineren, zoals dat bij inheemse bacteriën wordt geëlimineerd. Dit kan ook worden gebruikt om defecten in de RNA-verwerking te herstellen.

Maar er zijn nog veel meer manieren om nucleïnezuren te modificeren die nuttig kunnen zijn. Het is een open vraag of er enzymen zijn geëvolueerd die aanvullende wijzigingen aanbrengen. Daarom besloten sommige onderzoekers ernaar te zoeken.

Onderzoekers van MIT hebben een nieuw hulpmiddel ontwikkeld om variante CRISPR-arrays te detecteren en dit toegepast op 8,8 tera (1.012) basenparen prokaryote genomische informatie. Veel van de gevonden systemen zijn zeldzaam en zijn pas de afgelopen tien jaar in de dataset verschenen. Dit onderstreept hoe belangrijk het is om door te gaan met het toevoegen van milieumonsters die voorheen moeilijk te verkrijgen waren in deze gegevensopslagplaatsen.

Het nieuwe hulpmiddel was nodig omdat databases met eiwit- en nucleïnezuursequenties zich in een belachelijk tempo uitbreiden, dus de technieken voor het analyseren van al die gegevens moeten gelijke tred houden. Sommige van de algoritmen die worden gebruikt om ze te analyseren, proberen elke sequentie met elke andere sequentie te vergelijken, wat duidelijk onhoudbaar is als het om miljarden genen gaat. Anderen vertrouwen op clustering, maar vinden alleen genen die sterk op elkaar lijken, zodat ze geen licht kunnen werpen op de evolutionaire relaties tussen ver verwante eiwitten. Maar snelle, locatiegevoelige clustering op basis van hashtags (“flash-assemblage”) werkt door miljarden eiwitten te groeperen in kleinere en grotere reeksen sequenties die slechts in geringe mate verschillen om nieuwe en zeldzame verwanten te identificeren.

Een zoekopdracht met FLSHclust leverde met succes 188 nieuwe CRISPR-Cas-systemen op.

Veel knapperigheid

Uit het werk kwamen enkele thema’s naar voren. Een daarvan is dat sommige van de nieuw geïdentificeerde CRISPR-systemen Cas-enzymen gebruiken met domeinen die nog nooit eerder zijn gezien, of die fusies lijken te zijn met bekende genen. De wetenschappers karakteriseerden ook enkele van deze enzymen en ontdekten dat één specifieker is dan de CRISPR-enzymen die momenteel in gebruik zijn, en dat een ander RNA snijdt dat volgens hen structureel verschillend genoeg is om een ​​geheel nieuw type 7 CRISPR-Cas-systeem te omvatten.

Een uitvloeisel van dit onderwerp is het koppelen van enzymen met verschillende functies, niet alleen nucleasen (enzymen die DNA en RNA knippen), met CRISPR-arrays. Wetenschappers hebben het opmerkelijke vermogen van CRISPR om genen te targeten uitgebuit door het aan andere soorten enzymen en moleculen te koppelen, zoals fluorescerende kleurstoffen. Maar blijkbaar was de evolutie er eerst.

FLSHclust identificeerde bijvoorbeeld iets dat een transposase wordt genoemd en dat wordt geassocieerd met twee verschillende soorten CRISPR-systemen. Transposase is een enzym dat helpt een specifiek deel van het DNA over te brengen naar een ander deel van het genoom. CRISPR RNA-gerichte transformatie is al eerder gezien, maar dit is er nog een voorbeeld van. Er is een hele reeks eiwitten met verschillende functies gevonden, zoals eiwitten met transmembraandomeinen en signaalmoleculen, geassocieerd met CRISPR-arrays, wat de mix-and-match-aard van de evolutie van deze systemen benadrukt. Ze vonden zelfs een eiwit dat tot expressie wordt gebracht door een virus dat zich aan CRISPR-arrays bindt en deze inactief maakt, waarbij het virus in wezen het CRISPR-systeem uitschakelt dat is ontwikkeld om te beschermen tegen virussen.

Niet alleen vonden de onderzoekers nieuwe eiwitten geassocieerd met CRISPR-arrays, ze vonden ook andere regelmatig gespreide repeat-arrays die niet geassocieerd waren met Cas-enzymen, vergelijkbaar met CRISPR maar niet met CRISPR. Ze zijn niet zeker van de functie van deze RNA-geleide systemen, maar speculeren dat ze net als CRISPR betrokken zijn bij de verdediging.

De auteurs gingen op zoek naar “een lijst van RNA-geleide eiwitten die ons begrip van de biologie en evolutie van deze systemen vergroten en een startpunt bieden voor de ontwikkeling van nieuwe biotechnologieën.” En ze lijken hun doel te hebben bereikt: “De resultaten van dit werk onthullen ongekende regelgevende en functionele flexibiliteit en modulariteit van CRISPR-systemen”, schrijven ze. Ze concluderen verder: “Dit vertegenwoordigt slechts een klein deel van de ontdekte systemen, maar het benadrukt de omvang van het onaangeboorde potentieel van de biodiversiteit op aarde.” , De biodiversiteit van de aarde, en de resterende kandidaten, zullen dienen als een hulpbron voor toekomstige verkenning.

Artikel DOI: 10.1126/science.adi1910